Экспериментальная оценка антисептической активности хлоргексидина биглюконата и хвойно-солевого концентрата в отношении S. Mutans

Эффективная ежедневная профилактика воспалительных заболеваний пародонта и кариеса зубов:

• подходят для ежедневного использования (не содержат хпорорганических соединений);
• применяются после удаления зуба, установки имплантатов и брекет-систем;
• способствуют улучшению состояния мягких и твердых тканей пародонта;
• препятствуют образованию мягкого зубного налета;
• хорошо дезодорируют полость рта.

Разработано на основе фундаментальных исследований Санкт-Петербургской государственной лесотехнической академии им. С.М.Кирова.

Местное применение растворов хлоргексидина биглюконата обладает рядом недостатков, а также может иметь низкую эффективность при длительном использовании средств на основе данного антисептика в анамнезе. В статье представлены результаты сравнительной оценки антисептической эффективности растворов хлоргексидина биглюконата и хвойно-солевого концентрата (ХСК) in vitro, приведено обоснование применения 5% раствора ХСК в комплексной терапии воспалительных заболеваний пародонта.

Актуальность исследования

Одной из ведущих причин потери зубов у взрослого населения РФ являются воспалительные заболевания пародонта, в частности — хронический генерализованный пародонтит (ХГП). Так, признаки поражения тканей пародонта имеют более 40% подростков и более 80% взрослых [15, 28]. Таким образом, повышение эффективности лечения ХГП видится актуальной задачей современной отечественной стоматологии.

Ввиду инфекционной этиологии заболевания, а также сравнительно высокой травматичности оперативных вмешательств по поводу ХГП средней и тяжёлой степени, в послеоперационном периоде, как правило, в рамках комплексного лечения проводится курс антибактериальной терапии в сочетании с местным применением антисептиков [11, 13, 25]. Как правило, эффективность лечения ХГП тем выше, чем на более ранней стадии развития заболевания оно было начато. Нередко пациенты игнорируют симптомы воспалительных заболеваний пародонта (ВЗП) либо пытаются купировать их, самостоятельно используя местные средства на основе антисептиков (в основном — хлоргексидин биглюконат), а также антибактериальные препараты. Нерациональное применение антибиотиков и антисептиков закономерно приводит к снижению чувствительности микрофлоры к антибактериальным препаратам [22].

Так, антибиотикорезистентность называется одним из главных вызовов для медицины XXI века в целом [26, 32], а также для стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, в частности [17]. Несмотря на распространённое мнение о том, что одно из наиболее часто применяющихся в стоматологии антисептических средств — раствор хлоргексидина биглюконата — не приводит к развитию резистентности микроорганизмов [20, 30], в ряде исследований отмечаются спорные и противоположные результаты [9, 23], что подтверждается трудностями при купировании обострения ВЗП и большим риском осложнений в послеоперационном периоде по поводу ВЗП в случае, если имело место длительное применение зубных паст и(или) ополаскивателей полости рта на основе данного препарата. Кроме того, применение хлоргексидина биглюконата может являться причиной нарушения вкусовой чувствительности и окрашивания зубов [22].

В связи с вышесказанным, поиск новых антимикробных средств и разработка способов их применения являются одним из актуальных направлений исследований в стоматологии [31]. Как правило, новые антимикробные препараты включаются в список резервных, что, в сочетании с относительно коротким временем действия патента на производство, а также огромными финансовыми и временными затратами, делает их разработку нерентабельной для фармацевтических компаний [10]. Поэтому видится оправданным повышенное внимание исследователей к лечебным средствам растительного происхождения [1, 27].

Тесное сосуществование бактерий и растений на протяжении сотен миллионов лет привело к развитию у последних антибактериальных свойств, которые в той или иной степени проявляются практически у всех растений. Высокая антимикробная активность фитонцидов, известная с древнейших времен, лежит в основе народной медицины, имеет теоретическое обоснование и широко используется в медицине [29].

Многие фитопрепараты (лекарственные средства на основе растительного сырья), обладая естественными антимикробными свойствами, имеют ряд преимуществ над синтетическими антисептиками и антибиотиками. К таким преимуществам можно отнести меньший риск развития дисбактериозов, меньшую токсичность и аллергенность, а также возможность длительного применения без развития резистентности микроорганизмов [6].

К фитопрепаратам, имеющим известную в народе эффективность в отношении борьбы с заболеваниями дёсен, в первых рядах можно отнести продукты переработки хвойных растений и хвою в чистом виде. Так, препараты на основе хвои широко применялись в качестве источника витаминов в годы блокады Ленинграда [4]. Хвоя характеризуется содержанием до 35% эфирных масел (пиненов, сильвестрена, дипентена, кадиена), разнообразных фенольных соединений (в том числе флавоноидов, полимерных — таннидов и танинов), высоким содержанием аскорбиновой кислоты, токоферолов и токотриенолов, каротиноидов и других биологически активных веществ, благодаря чему обладает выраженным антисептическим, противовоспалительным, иммуностимулирующим и другими действиями [5, 12, 14, 16, 19, 21].

Цель исследования

Целью данного исследования явилась оценка антисептических свойств хвойных фитопрепаратов в отношении пародонтопатогенной микрофлоры на примере S. mutans.

Материалы и методы исследования

С целью оценки антисептических свойств хвойных фитопрепаратов нами была разработана модель их воздействия на пародонтопатогенную микрофлору, включавшая в себя в качестве эталонного микроорганизма S. mutans. Данный микроорганизм является факультативным анаэробом. Установлено, что именно S. mutans достоверно чаще определяется в содержимом пародонтальных карманов при хроническом генерализованном пародонтите [24], а также играет роль в развитии кариеса зубов [7].

Культура S. mutans для проведения исследования была предоставлена отделом молекулярной микробиологии ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины».

В качестве фитопрепарата на хвойной основе нами был применён хвойно-солевой концентрат с пастой хвойной производства фирмы «Фитолон-Мед» (Санкт-Петербург). Хвойно-солевой концентрат с пастой хвойной (ХСК) представляет из себя смесь пасты, получаемой при переработке хвои, преимущественно сосны (Pinus sylvestris) и ели (Picea abies), с ископаемой солью древнего моря. Применение препаратов на основе хвойного концентрата показало высокую эффективность в комплексной терапии воспалительных заболеваний ЛОР-органов [16, 18]. Сочетание пасты хвойной с ископаемой солью делает данный продукт перспективным для применения в стоматологии, так как антисептическое и противовоспалительное действие хвои дополняется противоотёчным действием на ткани пародонта в случае приготовления гипертонического раствора. Также стоит отметить богатый минеральный состав препарата, располагающий к оптимизации иммунных процессов в полости рта.

Для оценки антисептических качеств хвойносолевого концентрата с пастой хвойной применялся суспензионный метод оценки бактерицидной активности, описанный в руководстве, утвержденном Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 1 июня 2010 года [18]. После культивирования чистой культуры S. mutans на кровяном агаре, обогащенном дрожжевым экстрактом, выполнялось приготовление бактериальной взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия путём смыва бактериальных клеток с поверхности плотной питательной среды. Содержание бактериальных клеток (колониеобразующих единиц, КОЕ) оценивалось при помощи денситометра “VitekDensiChek”, производство компании “bioMérieux”, и соответствовало стандарту мутности 5 единиц по МакФарланду (1,5×10⁹ КОЕ/мл).

Исследование эффективности антисептиков проводили чашечным методом [3]. Бактериальную взвесь в количестве 0,5 мл непосредственно после приготовления смешивали с 4,5 мл исследуемых растворов, которыми выступили:

• изотонический раствор натрия хлорида (1-я группа, контрольная);
• 2,5% раствор хвойно-солевого концентра с пастой хвойной (2-я группа);
• 5% раствор хвойно-солевого концентрата с пастой хвойной (3-я группа);
• 0,02% раствор хлоргексидина биглюконата (4-я группа).

Таким образом, полученная смесь исследуемых растворов с бактериальной взвесью в количестве 5 мл содержала порядка 10⁸ КОЕ/мл. После экспозиции 5 и 10 минут, 0,5 мл взвеси микроорганизмов в исследуемых растворах смешивались с 4,5 мл универсального нейтрализатора, содержащего Твин-80 (3%), сапонин (1%), гистидин (0,1%), цистеин (0,1%) [18].

После пятиминутной экспозиции 0,5 мл взвеси разбавлялось стерильной водой в количестве 4,5 мл, затем при помощи стерильного стеклянного шпателя выполнялся посев по 0,1 мл полученной взвеси на плотную питательную среду в чашки Петри (диаметром 100 мм в количестве 20 штук на каждую группу), в том числе по 10 чашек Петри на экспозицию 5 и 10 минут соответственно (итого — 80 чашек). Таким образом, количество микроорганизмов в каждой чашке Петри составляло порядка 10⁶ КОЕ, что обеспечивало объективную оценку снижения числа жизнеспособных бактериальных клеток в диапазоне пяти порядков [2]. Далее чашки Петри помещались в среду с повышенным содержанием углекислого газа и выдерживались в термостате при температуре 37^ОС в течение двух суток.

После подсчета колоний в трёх репрезентативных участках (размером 10х10 мм), в каждой чашке Петри производился расчёт антисептической эффективности исследуемого раствора по формуле:

X=(1-((79*(N₁+N₂+N₃))/(3*106))*100%, (1)

где Х — антисептическая эффективность исследуемого раствора;
79 — примерная площадь чашки Петри диаметром 100 мм, см²;
N_1-3 — количество колоний S. mutans в каждом из трёх участков подсчёта площадью 1 см² каждый;
3 — количество участков подсчёта колоний S. mutans;
106 — количество КОЕ в 0,1 мл бактериальной взвеси S. mutans, посев которой произведен на каждую чашку Петри.

Результаты исследования и их обсуждение

Количество колоний S. mutans в чашках Петри 1-й (контрольной) группы составляло порядка 10⁶, что соответствовало количеству КОЕ в 0,1 мл бактериальной взвеси, посев которой производился. Таким образом, антисептического воздействия раствора натрия хлорида 0,9% выявлено не было.

Количество колоний в чашках 4-й группы (раствор хлоргексидина биглюконата 0,02%) ввиду их низкой плотности подсчитывалось на всей поверхности питательной среды в чашке Петри и в среднем составило 21,4±0,82 на чашку для экспозиции 5 минут и 20,6±0,75 для экспозиции 10 минут. Таким образом, антисептическая эффективность раствора хлоргексидина биглюконата 0,02% составила в обоих случаях примерно 99,9979%.

В случае экспозиции взвеси микроорганизмов с 2,5% раствором хвойно-солевого концентрата в течение 5 и 10 минут, было отмечено подавление роста 95,86±0,24% и 98,79±0,04% колоний соответственно.

В случае применения 5% раствора хвойносолевого концентрата, антисептическая эффективность при экспозиции 5 минут примерно соответствовала 10-минутной экспозиции 2,5% раствора и составила 98,28±0,08%. При экспозиции бактериальной взвеси с 5% раствором в течение 10 минут, наблюдалось подавление роста 99,858±0,004% бактерий.

Выявленная in vitro антисептическая эффективность применения 5% раствора хвойно-солевого концентрата позволила успешно применить его в клинической практике в составе комплексного лечения воспалительных заболеваний пародонта.

Выводы

1. Применение 0,02% раствора хлоргексидина биглюконата приводит к снижению количества клеток S. mutans не менее чем на 5 порядков уже при экспозиции 5 минут, при этом двойное увеличение времени экспозиции не приводит к существенному увеличению антисептической эффективности (p>0,05). Таким образом, учитывая свойство хлоргексидина биглюконата связываться с эпителием в течение длительного времени [22], можно сделать вывод о крайне высокой эффективности местного применения раствора этого антисептика в комплексной терапии воспалительных заболеваний пародонта даже при более короткой экспозиции данного раствора.
2. Применение 2,5% раствора ХСК не обеспечивает необходимого уровня антисептической эффективности в отношении S. mutans даже в случае экспозиции 10 минут, что не позволяет рекомендовать данный раствор в качестве альтернативы традиционным растворам применяемых антисептиков.
3. Подавление роста 99,858±0,004% бактерий в случае применения 5% раствора хвойно-солевого концентрата с пастой хвойной с экспозицией 10 минут позволяет говорить об удовлетворительных свойствах данного раствора как антисептика, хоть и существенно более слабого по сравнению с 0,02% раствором хлоргексидина биглюконата (p<0,001). Поэтому, учитывая наличие сопутствующих нежелательных свойств хлоргексидина биглюконата, местное применение 5% раствора хвойно-солевого концентрата может быть рекомендовано в клинической практике.

Авторы:

Г.А.Гребнев
засл. врач Российской Федерации, д.м.н., профессор, зав. кафедрой челюстно-лицевой хирургии и хирургической стоматологии, ФГБВОУ ВО “Военно-медицинская академия им. С.М.Кирова” Минобороны России

В.А.Андреев
к.м.н., доцент кафедры микробиологии, ФГБВОУ ВО “Военно-медицинская академия им. С.М.Кирова” Минобороны России

А.М.Ковалевский
засл. изобретатель Российской Федерации, д.м.н., доцент кафедры терапевтической стоматологии, ФГБВОУ ВО “Военно-медицинская академия им. С.М.Кирова” Минобороны России

В.А.Ковалевский
аспирант кафедры челюстно-лицевой хирургии и хирургической стоматологии, ФГБВОУ ВО “Военно-медицинская академия им. С.М.Кирова” Минобороны России

К.А.Павловская
ординатор клиники кафедры челюстно-лицевой хирургии и хирургической стоматологии,ФГБВОУ ВО “Военно-медицинская академия им. С.М.Кирова” Минобороны России

Литература:

1. Антибактериальное средство - родиола розовая: пат. 2137488 Российская Федерация, МПК 6А 61К 35/78 А
   / А.И.Яременко, Т.М.Алехова, С.А.Лобанов; заявитель и правообладатель Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П.Павлова. - №96117132/14; заявл. 20.08.1996; опубл. 20.09.1999.
2. Антоновская Л.И. Выбор методов, условий испытаний и параметров оценки антибактериальных свойств биоцидных препаратов
   / Л.И.Антоновская, Н.А.Белясова// Труды БГТУ. - Минск: БГТУ, 2011. - № 4 (142). - С. 178-181.
3. Афиногенов Г.Е. Чашечный метод оценки эффективности дезинфектантов и антисептиков
   / Г.Е.Афиногенов, М.В.Краснова // Методические рекомендации МЗ РФ №2003/17. - 2004. - 13 с.
4. Беззубов А.Д. Витамины для блокадного Ленинграда
   / А.Д.Беззубов // Химия и жизнь. - 1985. - № 1. - С. 14-18.
5. Беспалов В.Г. Провитам - биоактивный комплекс из хвои сосны и ели
   / В.Г.Беспалов, В.Б.Некрасова, И.А.Шевченко, А.С.Вершинин. - СПб.: Нордмедиздат, 2012. - 52 с.
6. Грубиянов А.И. Лекарственные средства, применяемые при заболеваниях пародонта
   / А.И.Грубиянов, Н.А.Стариков // Пародонтология. - 1998. - №2. - С. 6-10.
7. Диагностика, лечение и профилактика стрептококкозов в Вооруженных Силах РФ: Руководство. - СПб., 2015. - 195 с.
8. Жинкова Н.М. Записки оториноларинголога-фониатра
   / Н.М.Жинкова. - СПб.: Нордмедиздат, 2010. - 14 с.
9. Заболевания пародонта
   / под. ред. Л.Ю.Ореховой. - М.: Поли Медиа Пресс, 2004. - 432 с.
10. Зубов П.В. Разработка новых антибактериальных препаратов - проблемы и перспективы
    / П.В.Зубов, В.В.Новикова // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - № 5. - С. 342.
11. Иванов В.С. Заболевания пародонта
    / В.С.Иванов. - М.: ООО “Медицинское информационное агентство”, 2001. - 299 с.
12. Йорданов Д. Фитотерапия
    / Д.Йорданов, П.Николов, А.Бойчинов. - София: Медицина и физкультура, 1976. - 349 с.
13. Кисельникова Л.П. Роль антибиотикотерапии в комплексном лечении заболевании пародонта
    / Л.П.Кисельникова // Институт Cтоматологии. - 1999. - №2. - С. 28-29.
14. Кудрявцева Т.В. Применение “инсадола” в комплексном лечении заболеваний пародонта
    / Т.В.Кудрявцева, Л.Ю.Орехова, А.В.Акулович // Пародонтология. - 1997. - № 2 (2). - С. 44-46.
15. Кузьмина Э.М. Профилактическая стоматология
    / Э.М.Кузьмина, О.О.Янушевич. - М.: Практическая медицина, 2016. - 544 с.
16. Курякина Н.В. Лекарственные растения и продукты пчеловодства, применяемые в стоматологии
    / Н.В.Курякина, О.А.Алексеева, Т.А.Третьякова, В.Г.Макарова. - М.: Мед. книга; Н. Новгород: Изд-во НГМА, 2000. - 282 с.
17. Ламонт Р.Дж. Микробиология и иммунология для стоматологов
    / Р.Дж.Ламонт, М.С.Лантц, Р.А.Берне, Д.Дж.Лебланка; пер. с англ. под ред. В.К.Леонтьева. - М.: Практическая медицина, 2010. - 504 с.
18. Методы лабораторных исследований и испытаний медико-профилактических дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности: руководство. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. - 615 с.
19. Некрасова В.Б. Лечебно-профилактические средства из биомассы дерева
    / В.Б.Некрасова. - СПб.: Издательство Политехнического университета, 2006. - 190 с.
20. Ньюман М. Антимикробные препараты в стоматологической практике
    / М.Ньюман, А.Винкельхофф. - М.: Квинтэссенция, 2014. - С. 224-227.
21. Осидак Л.В. Лесмин - хвойные таблетки: Методическое пособие для врачей
    / Л.В.Осидак, В.П.Дриневский, Е.С.Эрман [и др.] - СПб.: Нордмедиздат, 2013. - 24 с.
22. Пейдж К. Фармакология: клинический подход
    / К.Пейдж, М.Кертис, М.Уокер, Б.Хоффман; пер. с англ. Б.К.Романова. - М.: Логосфера, 2012. - 744 с.
23. Рыбак Н.А. Чувствительность / резистентность микроорганизмов, выделенных из биопленок, к антибактериальным средствам при хроническом тонзиллите
    / Н.А.Рыбак, Т.Н.Соколова, В.М.Цыркунов, О.Б.Островская // Клиническая инфектология и паразитология. - 2016. - Т. 5, № 2. - С. 27-38.
24. Тамарова Э.Р. Молекулярно-генетическая характеристика видового состава микробиоты слюны и десневых карманов при пародонтите
    / Э.Р.Тамарова, А.Х.Баймиев, К.Ю.Швец, А.Р. Мавзютов // Клиническая лабораторная диагностика. - 2015. - № 12. - С. 56-59.
25. Факультетская стоматология: руководство для врачей-стоматологов
    / под ред. А.К.Иорданишвили, А.М.Ковалевского. - М.: СИМК, 2015. - 504 с.
26. Чеботарь И.В. Антибиотикорезистентность биопленочных бактерий
    / И.В.Чеботарь и др. // Клин. микробиол. атимикроб. химиотер. - 2012. - Т. 14, № 1. - С. 51-58.
27. Чжан Фань. Сравнительный анализ результатов лечения пациентов с переломами нижней челюсти при различных методах щадящей иммобилизации отломков
    / Фань Чжан, И Юань, И.Г.Трофимов, Г.А.Хацкевич // Институт Стоматологии. - 2012. - № 2 (55). - С. 32-33.
28. Янушевич О.О. Стоматологическая заболеваемость населения России. Состояние тканей пародонта и слизистой оболочки рта
    / О.О.Янушевич. - М.: МГМСУ, 2009. - 120 с.
29. Braun L. Herbs and natural supplements: an evidence-based guide
    / L.Braun, M.Cohen. - New-York: Elsevier-Mosby, 2005. - 1200 p.
30. Briner W.W. Effect of chlorhexidine gluconate mouthrinse on  plaque bacterial.
    / W.W.Briner et al. // J.Periodontol. Res. - 1986. - Vol. 21. - P. 44-52.
31. Gordon J.M. Current status of systemic antibiotic usage in destructive periodontal diseases
    / J.M.Gordon et al. // J.Periodontol. - 1993. - Vol. 64. - P. 760-771.
32. Report by the Secretariat A70/12. Antimicrobial resistance. In: seventieth world health assembly. Geneva, 22-31 may 2017.
    / Geneva : World Health Oganization, 2017. - 5 p. (http://apps.who.int/gb/ebwha/pdf_fi les/wha70/a70_12-en.pdf).